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技術(shù)文章

提取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白的操作步驟點(diǎn)擊次數(shù):7098 更新時間:2020-05-08

在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中提取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白的操作步驟:

 

1.決定細(xì)胞生長狀態(tài),細(xì)胞生長狀態(tài)應(yīng)該是80%或者更好;

 

2.用離心機(jī)以1500r/min離心5min;

 

3.棄上清液,用等體積的冷PBS洗細(xì)胞,像步驟2那樣,反復(fù)3次;

 

4.根據(jù)估計的沉淀量加入5倍體積的isotonic lysis buffer到細(xì)胞顆粒中,使細(xì)胞溫和懸浮,盡量避免泡沫;

 

5.加入裂解液lysis buffer在懸浮的細(xì)胞中,并放在冰上15min讓細(xì)胞膨脹,可以通過顯微鏡檢查;

 

6.對于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中膨脹的細(xì)胞,加入10%的IGEPAL CA-630使*后的濃度達(dá)到0.3%,混勻,加的時候要溫和;

 

7. 立即離心(量大的可以用1.5mlde EP管,以5500r/min離心30s;量大的可以用50ml的管子以5500r/min離心2min);

 

8.轉(zhuǎn)移上清液(細(xì)胞質(zhì)蛋白)到一個新的冷凍管中;

 

9.用懸浮顆粒5倍體積的isotonic lysis buffer懸浮細(xì)胞,并混勻;

 

10.用離心機(jī)離心細(xì)胞懸浮液,以1500r/min離心5min,移掉上清液;

 

11.用2/3倍體積的extraction buffer懸浮顆粒;

 

12.把管子放置在震蕩混勻器上,以700r/min,15min震蕩混勻,接著以1400r/min,15min,整個過程要仔細(xì),避免泡沫產(chǎn)生;

 

13.以9400r/min離心15min,離心完后轉(zhuǎn)移上清液到一個新的冷凍離心管中;

 

14.分成幾份用液氮冷凍,并且保存起來(長期保存應(yīng)放在-80℃上,短期保存要放在-20℃上)。

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