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技術(shù)文章

蛋白酶K在具體實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用點(diǎn)擊次數(shù):969 更新時(shí)間:2020-12-24

  蛋白酶K經(jīng)純化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩(wěn)定,還具有降解天然蛋白質(zhì)的能力,因而它應(yīng)用很廣泛,包括制備脈沖電泳的染色體 DNA,蛋白質(zhì)印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg/ml。在較廣的pH范圍內(nèi)(pH 4-12.5)均有活性。
 
  蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn):20mg/ml蛋白酶K配制標(biāo)準(zhǔn)(proteinase K):將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中,輕輕搖動(dòng),直至蛋白酶K*溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml,然后分裝成小份貯存于-20℃。
 
  酶解與核酸結(jié)合的組蛋白,使 DNA游離在溶液中,隨后用不同方法進(jìn)行 抽提,除去雜質(zhì),收集DNA。EDTA等螯 合劑或SDS等去垢劑均不能使之失活。蛋 白酶K貯存液一般為10mg/ml或20mg/ml。 貯存于一20°C。蛋白酶K溶液為無(wú)色透明, 如出現(xiàn)沉淀就不能再使用。
 
  蛋白酶K在原位雜交技術(shù)中通常用于雜交前的處理,它具有消化包圍靶DNA蛋白質(zhì)的作用,以增加探針與靶核酸結(jié)合的機(jī)會(huì),提高雜交信號(hào).但蛋白酶K的濃度過(guò)高、消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或孵育溫度過(guò)高時(shí),都會(huì)對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有一定的破壞,導(dǎo)致組織切片的脫落,細(xì)胞核的消失,從而影響雜交結(jié)果.EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用,解決上述出現(xiàn)的問(wèn)題,并能達(dá)到理想的染色效果。
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