DNA片段純化常見問題
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1、DNA回收率低
A、溶膠液用量過少
準確計算凝膠的重量,按比例加入溶膠液。
B、凝膠塊未*融化
加入溶膠液后,置于55℃~60℃進行水浴,如有必要加入更多量的溶膠液。
C、電泳緩沖液使用時間過長,不新鮮
換用新配制的電泳緩沖液。
D、片段過小,<200 bp
加入1倍體積的異丙醇。
E、片段>10kb
加入洗脫液后,將吸附柱置于60℃,溫育15分鐘后進行離心洗脫。
F、洗脫液使用不正確
洗脫液pH在7.0~8.5之間時洗脫效果,pH過高或者過低,都將顯著影響洗脫效率,請使用試劑盒配送的洗脫液進行洗脫(10 mM Tris-HCL,pH8.5),使用ddH2O洗脫時請保證pH值在此范圍內。
G、洗脫液加入位置不正確
使用較小洗脫體積洗脫時,洗脫液應加在膜的中央。
H、起始產物量低
若初始回收產物的量很低,應先富集,增大起始產物量。
2、未回收到DNA
DNA Wash Buffer中未加入乙醇
加入規定用量的無水乙醇,使用后旋緊瓶蓋,以防乙醇揮發
3、電泳時,樣品飄出點樣孔或后續酶反應實驗不理想
乙醇殘留:洗脫前,應確保乙醇已去除干凈,可再次離心,以*去除殘留的乙醇后在進行洗脫操作。
4、柱子堵塞
凝膠未*融化:加入溶膠液后,置于55℃~60℃進行水浴,待凝膠*融化,冷卻至室溫后再過柱。