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蛋白酶抑制劑技術(shù)原理和選擇指南2點擊次數(shù):2431 更新時間:2019-04-04

當細胞破碎的時候,蛋白水解酶就會被釋放出來或被激活,使電泳結(jié)果復(fù)雜化,影響zui終結(jié)果分析。為了避免這些情況的出現(xiàn),建議在樣品制備時盡可能在低溫下進行。此外,許多蛋白酶在PH9以上就失活了,因此Tris堿,碳酸鈉或堿性載體兩性電解質(zhì)往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述條件下仍然保持著活性,此時應(yīng)當使用蛋白酶抑制劑。因此對于我們想要研究的蛋白來說,選擇性和有效的抑制這些蛋白酶對于蛋白純化路線設(shè)計來說顯得尤為重要。
蛋白酶抑制劑與蛋白酶一樣,都是紛繁復(fù)雜的,通常使用許多化學(xué)物質(zhì)作為蛋白酶抑制劑,如PMSF和leupeptin。而且由于一種蛋白酶抑制劑只對某一類蛋白酶起作用,因此通常建議復(fù)合使用蛋白酶抑制劑,如廣譜蛋白酶抑制劑“雞尾酒”,見下表(來自《蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)》)。

蛋白酶抑制劑有效抑制的酶
PMSF(Pheylmethylsulfonyl fluoride)是很常見的抑制劑,使用濃度為1mmol/L不可逆抑制絲氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。
AEBSF 絲氨酸抑制劑,使用濃度為4mmol/LAEBSF的抑制活性與PMSF相近,但它更易溶于水而且毒性低
EDTA,EGTA,使用濃度為1mmol/L通過鰲合蛋白酶維持活性所必需的金屬離子來抑制金屬蛋白酶。
多肽蛋白酶抑制劑,使用濃度為2-20ug/ml亮肽素(Leupeptin)能抑制多種絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶;抑肽素(pepstatin)抑制天冬氨酸蛋白酶;抑肽酶(aprotinin)能抑制許多絲氨酸蛋白酶;苯丁抑制劑(bestatin)能抑制氨基酸多肽酶
TLCk,TPCK,使用濃度為0.1-0.5mmol/L不可逆的抑制絲氨酸和半胱氨酸的蛋白酶
芐脒(Benzamidine)使用濃度為1-3mmol/L抑制絲氨酸蛋白酶

蛋白酶抑制劑的功能和分類
 蛋白酶功能 :
         涉及到許多細胞內(nèi)和細胞外的過程: 
1 食物蛋白在消化道的消化
2 激活無活性酶原和多肽激素/神經(jīng)轉(zhuǎn)移介質(zhì)的釋放
3 調(diào)節(jié)血凝物質(zhì)和纖維素
4 內(nèi)源性和外源性蛋白的細胞內(nèi)消化
5 跨膜的蛋白轉(zhuǎn)移
6 微生物對生物體攻擊,通過釋放蛋白酶的導(dǎo)致毒性增加
 蛋白酶分類 :
根據(jù)催化中心結(jié)構(gòu)的不同蛋白酶可分為4類 :
 1.   絲氨酸蛋白酶在其活性中心含有絲氨酸和組氨酸,如:  糜蛋白酶,彈性蛋白酶,血纖維蛋白溶酶,凝血酶,枯草桿菌蛋白酶,胰酶Chymotrypsin, Elastase, Plasmin, Subtilisin,Thrombin, Trypsin
 2.   半胱氨酸蛋白酶(別名 :硫醇或SH 蛋白酶)在其催化中心含有半胱氨酸,如 : Calpain, 組織蛋白酶 B,C 和L,和木瓜蛋白酶
 3   天(門)冬氨酸蛋白酶 (羧基蛋白酶)在其活化中心含有天(門)冬氨酸, 如 : 組織蛋白酶D, 木瓜蛋白酶, 腎素
 4.   金屬蛋白酶含有金屬離子, 即 : 鋅2+在其催化中心,如氨基肽酶,羧基蛋白酶A 和 B,嗜熱菌蛋白酶
   在分離蛋白時,組織或細胞裂解液中充滿了來自溶酶體的酶,并且原來無活性的蛋白酶原被充分激火,開始消化其周圍的蛋白質(zhì).為避免此因素,蛋白酶抑制劑必須被加入在緩沖液內(nèi)以阻止蛋白酶對細胞組織的消化作用. 來自哺乳類動物,植物, 霉菌或細菌的組織,蛋白酶成分是不同的,并根據(jù)機體狀態(tài)的發(fā)展蛋白酶也可以發(fā)生變化.  哺乳類動物組織分離時比細菌或其它組織分離時更需要應(yīng)用蛋白酶抑制劑使組織細胞受到*的保護.
 因此,在各種蛋白分離時,在各種蛋白電泳時蛋白酶抑制劑的適當選用就成了很重要的因素。

  羅氏蛋白酶抑制劑&磷酸酶抑制劑
cOmplete 是多種蛋白酶抑制劑的混合片劑:為水溶性片劑;同時持續(xù)抑制絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶及金屬蛋白酶等在內(nèi)的多種蛋白酶;可用于所有的組織及細胞,如動物、植物、酵母、細菌或真菌。
PhosSTOP保護蛋白質(zhì)不發(fā)生去磷酸化反應(yīng);可以抑制多種磷酸(酯)酶;適用于在細胞裂解過程中保護蛋白質(zhì),并且可以適用于多種不同來源的樣品(哺乳動物,植物,酵母);可以結(jié)合cOmpleysis Kits 和 cOmplete Protease Inhibitor CocktailTablets一起使用;這種抑制劑藥片可用于緩沖福爾馬林(福爾馬林固定術(shù))。

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